Come fa la glicerolo chinasi ricombinante a far fronte all'interferenza di rilevamento?

I trigliceridi (TG) sono una componente importante dei lipidi nel sangue e i loro livelli di concentrazione sono indicatori chiave per valutare il rischio di malattie cardiovascolari. Per molti anni, la rilevazione clinica dei trigliceridi si è basata principalmente sui kit di dosaggio immunoenzimatico (ELISA). Uno degli enzimi fondamentali in questo metodo, la glicerolo chinasi (GK), è responsabile della catalizzazione della generazione di glicerolo-3-fosfato dal glicerolo, dando inizio a una serie di reazioni enzimatiche e, in definitiva, determinando il contenuto di TG tramite fotometria. Tuttavia, le tradizionali fonti naturali di glicerolo chinasi sono spesso accompagnate da enzimi interferenti come la NADH ossidasi e la catalasi, che possono consumare i substrati di reazione o produrre reazioni collaterali, con conseguenti ampie deviazioni e scarsa riproducibilità dei risultati del rilevamento. Di fronte ai punti critici di questo settore, la glicerolo chinasi ricombinante è emersa, guidando i test clinici verso una nuova era di precisione con le sue caratteristiche di elevata purezza e bassa interferenza.

1, Problema degli enzimi interferenti: l'"assassino invisibile" del rilevamento tradizionale

Nel processo di dosaggio immunoenzimatico per la rilevazione dei trigliceridi, la glicerolo chinasi deve lavorare in sinergia con la glicerolfosfato ossidasi, la perossidasi e altri enzimi per produrre sostanze cromogene attraverso la reazione di Trinder. Tuttavia, se la preparazione di glicerolo chinasi contiene NADH ossidasi, questa degraderà in modo non specifico la NADH (coenzima I ridotto), con conseguente diminuzione dell'assorbanza; se è presente catalasi, questa decomporrà il perossido di idrogeno generato nella reazione, riducendo l'intensità del colore. La presenza di questi due enzimi interferenti può causare deviazioni dalla curva standard nei casi lievi e invalidare completamente i risultati del rilevamento nei casi gravi. Le fonti naturali di glicerolo chinasi (come quelle estratte da batteri o funghi) sono spesso difficili da rimuovere completamente a causa dei loro complessi processi di estrazione e delle difficoltà di purificazione, rendendole un collo di bottiglia che limita l'accuratezza del rilevamento.

2, Tecnologia ricombinante: purificare dalla fonte e creare 'enzimi puri'

La svolta nella tecnologia del DNA ricombinante ha portato cambiamenti rivoluzionari alla produzione di glicerolo chinasi. Introducendo il gene della glicerolo chinasi in batteri ingegnerizzati come Escherichia coli e ottimizzando le condizioni di espressione, la glicerolo chinasi ricombinante può raggiungere un'espressione efficiente e controllabile. Ancora più importante, il sistema di produzione ricombinante evita la coesistenza di più enzimi nei ceppi naturali e i successivi processi di purificazione di precisione come la cromatografia e l'ultrafiltrazione possono rimuovere efficacemente i componenti interferenti come la NADH ossidasi e la catalasi. La purezza della glicerolo chinasi ricombinante è superiore al 95%, che è molto più alta di quella delle preparazioni enzimatiche naturali, tagliando la via alla contaminazione da enzimi interferenti dalla fonte.

3, Miglioramento della stabilità: risposta scientifica ai problemi di sensibilità alla temperatura

Sebbene la glicerolo chinasi ricombinante presenti vantaggi significativi in termini di purezza, la sua stabilità in ambienti superiori a 45 ℃ è scarsa, il che è stato un tempo uno degli ostacoli alla sua ampia applicazione. Attraverso modifiche di ingegneria proteica come la mutagenesi sito-diretta e la progettazione razionale, i ricercatori hanno migliorato con successo la stabilità termica degli enzimi. Allo stesso tempo, l'ottimizzazione del sistema tampone e della combinazione di agenti protettivi nella formulazione (prestando attenzione ad evitare gli effetti negativi del trealosio) ha ulteriormente esteso il tempo di conservazione e la durata di utilizzo dell'attività enzimatica. Al giorno d'oggi, la glicerolo chinasi ricombinante di alta qualità può mantenere l'attività per lungo tempo a 4 ℃ ed esibirsi in modo robusto in condizioni di rilevamento a temperatura ambiente, soddisfacendo pienamente i requisiti di conservazione e funzionamento del kit di reagenti.

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