Application of TRIS Buffer in Plasmid Extraction by Agarose Electrophoresis

Tris (triidrossimetilaminometano) è una base debole con un pKa di 8,1 a temperatura ambiente di 25°C e un intervallo di tampone efficace di pH 7,0 ~ 9.2Il pH della soluzione acquosa di Tris alcalino è di circa 10.5L'acido cloridrico è generalmente aggiunto per regolare il valore del pH al valore desiderato, in modo da ottenere il tampone di questo valore di pH.Il DNA verrà deprotonato in tale soluzione, migliorando così la sua solubilità.Se la soluzione acida regolata al pH viene sostituita con acido acetico, si ottiene un "buffer TAE" (Tris/Acetato/EDTA),mentre si ottiene un "buffer TBE" (Tris/borato/EDTA) sostituendolo con acido boricoQuesti due tamponi sono comunemente utilizzati negli esperimenti di elettroforesi degli acidi nucleici.0) viene utilizzato principalmente per sciogliere il DNA.(TE è una combinazione di Tris e EDTA.)1MTris-HCl6.8 e 1.5MTris-HCl8.8 sono i reagenti più comunemente utilizzati per SDS-PAGE.

Reagente TRIS

Tra le operazioni convenzionali di ingegneria genetica, l'elettroforesi a gel di agarosio è la più utilizzata.identificare e purificare frammenti di DNADi solito utilizza un dispositivo di elettroforesi orizzontale per eseguire l'elettroforesi sotto un campo elettrico con intensità e direzione costanti.Le molecole di DNA sono cariche negativamente in gel buffer (generalmente alcalini) e migrano da elettrodi negativi a positivi in un campo elettrico.Il tasso di migrazione delle molecole di DNA dipende dalle dimensioni e dalla conformazione della molecola.L'influenza della forza e della direzione del campo elettrico, della composizione delle basi, della temperatura e dei coloranti incorporati,ecc.

Operazioneprocesso:

1 tampone TE: (10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA)

Buffer di elettroforesi (50XTAE)

2 tampone di elettroforesi (50XTAE): Tris 242 g, acido acetico glaciale 57,1 ml, EDTA (0,5 mol/ L pH 8,0) 100 ml

Diluire 50 volte con acqua distillata quando utilizzato.

3 Buffer del campione (6X): 0,25% blu bromofenolo, 0,25% blu xilene, 40% (W/V) saccarosio

4 tampone STET (pH 8,0) (8% saccarosio, 0,5% Tritone, 50 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris)

1) Misurare 100 ml di soluzione di elettroforesi TAE, aggiungere 0,7 g di agarosio, mescolare bene, mettere nel forno a microonde, riscaldare per 3 minuti, sciogliere completamente l'agarosio.

2) Chiudere la piastra elettroforetica pulita e asciutta con gomma sterilizzata e sigillare il bordo con una piccola quantità di soluzione di agarosio.Posizionare il pettine e regolare la distanza tra il bordo inferiore del pettine e la piastra di elettroforesi, generalmente 1-2 mm è appropriato.

3) Quando la soluzione di agarosio disciolta è raffreddata a circa 50 °C, aggiungere 5 M L di bromuro di etidio e la concentrazione finale di bromuro di etidio è di 1,0 m g/m L. Dopo la miscelazione,versare la soluzione di agarosio nella piastra di elettroforesi e tenerla ferma senza muoversi.

4) Dopo che il gel si è completamente solidificato (30-45 minuti a temperatura ambiente), rimuovere delicatamente il pettine, rimuovere il nastro e mettere il gel nel pad di elettroforesi.

5) Nel processo di elettroforesi, è stata aggiunta una soluzione di elettroforesi (1'TAE) per coprire la superficie del gel di agarosio con una soluzione di elettroforesi di circa 1-2 mm.